放线菌素D能与DNA双螺旋结合产生细胞毒性。与脱氧鸟苷间形成的结晶性复合物的调衍射研究表明本品的酚恶嗪酮(phenoxazone)环平面可嵌入到DNA的鸟苷和胞苷的碱基对之间,其肽链部分则沿着螺旋小沟伸展。这样,就使本品与DNA结成的复合物很稳定,结果阻断了RNA多聚酶对DNA的转录。DNA依赖的RNA多聚酶要比DNA多聚酶对本品的作用敏感得多。此外,本品亦引起DNA单链断裂,这可能通过游离基中介或通过TopbI的作用。
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